一、研究开发内容
1) 建立DAA不同耐药基因变异的检测方法
目前虽然DAA没有在国内上市,但已经进入临床试验阶段,而欧美已经批准DAA用于难治性基因1b型HCV感染者,但发现部分治疗病人很快发生耐药变异,故HCV感染者存在原发和继发耐药,通过建立HCV针对不同DAA耐药基因检测方法,为不久的将来DAA在国内临床运用筛选合适病人提供切实可行的方法。
2) 对DAA耐药变异准种HCV感染者临床特征及相关因素研究
通过对不同人群、不同基因型、不同基因亚型HCV感染及采用SOC治疗效果不佳的CHC患者对DAA原发耐药状况的比较分析,及体内有无DAA耐药HCV准种的两组患者临床及免疫指标的比较分析,耐药相关因素分析,明确HCV对于DAA耐药变异准种感染患者的临床特征及影响DAA耐药发生的相关因素,为预测疗效、规避HCV针对DAA耐药的产生,推广并应用DAA-R基因检测作为预测指标指导CHC患者运用DAA进行抗HCV治疗,将对进一步优化CHC患者国内运用DAA个体化抗病毒治疗方案的制订具有指导性意义。
3) 针对DAA耐药变异株HCV生物学特性的研究
筛选出HCV针对DAA耐药的不同变异准种,构建不同类DAA不同耐药变异准种的表达质粒,并建立不同耐药变异准种稳定表达的细胞系,为将来进一步体外研究耐药变异准种HCV的生物学特性及治疗提供可靠模型。
二、研究技术方法
1、病例选择:收集病例诊断300例丙型肝炎患者,诊断符合2010年《病毒性肝炎防治方案》标准。所有HCV感染者均除外HIV、HBV、HDV、CMV等病毒感染及自身免疫性疾病、酒精性肝病及脂肪肝,并排除肝硬化、肝癌等。本研究方案已经徐州医学院附属医院医学伦理委员会批准。包括50例慢性丙型肝炎患者,年龄16~40岁,符合α-干扰素抗病毒指征,无α-干扰素应用禁忌症。接受聚乙二醇α-干扰素或普通α-干扰素2b抗病毒治疗,其中聚乙二醇干扰素-α2a(派罗欣)每周一次皮下注射,每次135或180 ug;普通干扰素-α2b(安福隆)每次300或500万单位,皮下注射,隔日一次。。
2、标本收集:收集丙肝病人的血清,部分病例采用干扰素治疗的,干扰素-α抗病毒治疗0、3、6、12月及疗程结束后随访6、12月采集慢丙肝患者外周静脉血,分离血清和外周血单个核细胞(PBMCs)。部分患者于治疗前和治疗12月时进行肝组织活检。
1)血清采集:置于-20℃保存。
2)PBMCs分离:采集研究对象抗凝外周静脉血,使用淋巴细胞分层液分离PBMCs。部分PBMCs在含80%胎牛血清、10%DMSO及10% RPMI 1640的冻存液中保存于液氮中备用。
3)肝组织活检:超声波引导下用活检枪和一次性18G肝穿针进行穿刺获取不少于2.0cm 的肝组织。肝组织常规甲醛固定,石蜡包埋,切片,HE染色。
3、检测DAA耐药方法的建立
分离血清:取2 ml新鲜静脉血,以4000 rpm离心5 min,吸取上层血清每管分装140 ul,-80℃冻存。RT-PCR及产物测序:采用Trizol提取总RNA,测定浓度和纯度,进行逆转录合成cDNA,设计荧光引物,对cDNA产物进行定性PCR扩增,对于荧光定量超过1000 IU/ml的样本,进行测序分析,根据测序结果根据测序结果分析有无DAA耐药变异准种。
4、DAA耐药变异准种表达质粒构建及鉴定
设计含有酶切引物,对测序含有DAA耐药变异优势准种再次进行扩增,并将产物纯化酶切,连接到pcDNA3.1和pEGFP-N1中,转化细菌,挑选阳性克隆,酶切及测序鉴定。
5、DAA耐药变异准种真核表达克隆构建
采用分子克隆的方法,设计引物扩增含有DAA耐药变异准种的NS3-5的基因片段,纯化、酶切连接到pcDNA3.1和pEGFP-N1中,转染HepG2及Huh-7细胞,用G418筛选获得稳定表达细胞株,为体外观察变异耐药准种株的生物学特性,也为将来观察其他新的治疗药物提供选择的细胞模型。
6、DAA耐药变异准种与野生株的生物学特性比较研究
对发生DAA耐药变异准种的其它区段进行序列分析,并与野生株进行比对,观察teleprevir及boceprevir有无其它新的变异(继发变异)和其它DAA交叉变异,不同基因型HCV感染者发生DAA-R比较,揭示DAA-R生物学特性。
7、DAA耐药变异准种分子流行状况研究
明确DAA原发耐药在HCV感染人群中流行状况及同一个体内动态变化。通过PCR产物直接测序方法发现存在DAA耐药变异患者和野生株患者,再采用构建A-T克隆,明确不同准种(耐药变异准种和WT)在患者体内的动态变化。即对扩增产物PCR产物凝胶纯化,PCR产物加A尾PCR产物与pGEM-T Easy载体连接,连接产物转化,质粒提取,酶切鉴定,阳性质粒测序,分析DAA原发耐药变异在HCV感染人群中发生状况。观察部分在干扰素治疗反应不佳的患者中是否存在DAA原发耐药及耐药变异准种的体内的载量的变化。
8、DAA耐药变异发生的相关性因素研究
对于发现DAA耐药变异患者与野生株感染(无DAA耐药变异准种患者)两组患者临床指标的比较分析,探讨预测DAA耐药变异的相关质保。
1)血清学检测:采用微量样本多指标流式蛋白定量技术(cytometric bead array CBA)检测相关的细胞因子。荧光定量PCR技术检测HCV RNA水平(检测下限<1000copies/ml)。化学发光法检测检测抗-HCV。主要包括以下指标:
(1)肝功能检测:留取患者的血清,采用本院全自动生化仪检测。
(2)IL-35、IL-10及TGF-β细胞因子检测:外周静脉血血清,采用ELISA法,按照加样、温浴、洗涤、读板等步骤进行,每空均设置复孔,以减少实验误差。
(3)调节性T细胞(Treg)检测:留取患者外周血,送本院中心实验室,检测外周血中Treg所占频率。
(4)HCV基因型分析:留取标本,扩增HCV RNA,用本研究室的自动测序仪对HCV RNA进行基因型及亚型进行分析。
2)肝组织学检测 1)肝脏组织病理学观察; 2)肝组织中IL-21表达 免疫组织化学(SP)法测定肝组织中IL-21的表达。
9、DAA-R与WT临床及致病机制比较研究
DAA-R与WT临床及致病机制比较研究:对DAA-NR与WT患者的临床特点、在不同感染状态中所占比例、采用SOC治疗后反应及机体的免疫功能状况进行比较,揭示DAA-NR临床及致病机制特点。