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预测HCV对DAA原发耐药基因检测及耐药变异准种株感染临床特点研究
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挂牌 挂牌开始时间: 2021-12-01 剩余时间:12月
商品编号
45313694719191099850
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技术转让
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¥ 200,000 元

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徐州医科大学
电话 138xxxx6778
本项目开展DAA不同耐药变异准种HCV感染者的基础与临床自主研究,旨在建立DAA耐药基因的检测方法,为DAA在国内推广运用筛选合适病人、预测疗效提供可靠的检测方法;明确DAA不同耐药变异准种HCV感染的临床特点及预测变异发生的相关临床指标,对进一步规避耐药的产生、优化我国CHC患者运用DAA个体化抗病毒治疗方案的制订具有指导性意义;进一步构建DAA不同耐药变异准种原核及真核表达质粒,获得不同变异准种表达蛋白,建立DAA的不同耐药变异准种HCV稳定表达细胞系,为进一步研究不同类DAA耐药变异准种HCV生物学特性提供可靠的模型。
项目采用RT-PCR产物直接测序方法检测280例未经抗病毒治疗的HCV感染者的NS5A及NS5B区核苷酸序列,分析其对NS5A蛋白抑制剂及NS5B聚合酶抑制剂的DAA相关耐药(DAA associated resistance, DAA-R)位点,同时对58例基因1b型NS5A-Y93H和104例NS5B-C316N感染者的野生株与变异株临床资料进行比较。对261例血清抗-HCV及HCV RNA阳性的慢性丙型肝炎(Chronic hepatitis C, CHC)患者的HCV进行基因分型,对其中170例未经抗病毒治疗的CHC患者用型特异性引物进行HCV NS3区基因扩增,PCR产物纯化后采用直接测序法分析有无针对NS3/4A PIs的天然耐药及其变异特征。
结果发现,在扩增成功208例患者中检测到NS5A区耐药变异位点M28L、F28L、Q30R/L、H54Q、P58S、E62Q和A92T、Y93H/M/T。检测到NS5B区耐药变异位点S282R/C、M289K/C、C316N/Q、V321G、L392F/I和M414L/M、V421A。而NS5B聚合酶抑制剂DAA-R的C316N发生率在基因1a型HCV感染者为100%,基因1b型为98%,基因2a型为4.65%,基因1a、1b型明显高于基因2a。NS5A-Y93H在基因1b型中发生率明显高于基因1a和2a型(P<0.05)。基因1b型NS5A-Y93H突变株在IL-28B(rs8099917)基因型TT型的CHC感染者发生率明显高于非TT型感染者(P<0.05)而rs12979860 CC型CHC感染者与非CC型CHC感染者两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。261例患者检测出6种基因亚型,主要为1b型147例(56.32%),其次为2a型95例(36.40%)、6a型11例(4.21%)、1a型4例(1.53%)、3a型2例(0.77%)、2b型2例(0.77%)。HCV NS3蛋白酶区可检测出V36L/M、Q41R、T54S、V55F、Q80L/R/G/K、A156S和V170I等PIs耐药相关位点变异。本研究提示1b和2a型为主要流行的HCV基因亚型,也存在一定的6a、1a、2b和3a型。各基因型患者的性别、年龄、肝功能及血清HCV RNA水平没有差异。CHC患者体内存在针对NS3/4A、NS5A蛋白抑制剂和NS5B聚合酶抑制剂的原发耐药位点。不同基因型患者对NS3/4A蛋白酶抑制剂的耐药相关变异率不同,1b型耐药变异率较低。不同基因型对DAAs耐药相关位点发生率不同,Y93H和C316N耐药相关位点在基因1b型CHC患者发生率明显高于基因2a型。
通过本课题,项目组基本建立了DAA不同耐药基因变异的检测方法,已发表相关文章4篇,待发表包括SCI论文2篇,为不久的将来DAA在国内临床运用筛选合适病人提供切实可行的方法,基本达到了项目阶段性指标。在扩增成功的148例标本中,我们发现了V36L/M、Q41R、T54S、V55F、Q80L/R/G/K、A156S、D168A和V170I位点变异,提示CHC患者体内存在针对NS3/4A蛋白酶抑制剂的天然耐药;不同基因型患者对NS3/4A蛋白酶抑制剂的耐药相关变异率不同,1b型耐药变异率较低。在下一步的工作中,我们将继续搜集标本,开展对其他类型DAA的原发耐药检测,同时对于有无变异组患者的病毒学、免疫学及肝组织学的指标进行统计比较分析。

研究开发内容

1)  建立DAA不同耐药基因变异的检测方法

目前虽然DAA没有在国内上市,但已经进入临床试验阶段,而欧美已经批准DAA用于难治性基因1bHCV感染者,但发现部分治疗病人很快发生耐药变异,故HCV感染者存在原发和继发耐药,通过建立HCV针对不同DAA耐药基因检测方法,为不久的将来DAA在国内临床运用筛选合适病人提供切实可行的方法。

2)  DAA耐药变异准种HCV感染者临床特征及相关因素研究

通过对不同人群、不同基因型、不同基因亚型HCV感染及采用SOC治疗效果不佳的CHC患者对DAA原发耐药状况的比较分析,及体内有无DAA耐药HCV准种的两组患者临床及免疫指标的比较分析,耐药相关因素分析,明确HCV对于DAA耐药变异准种感染患者的临床特征及影响DAA耐药发生的相关因素,为预测疗效、规避HCV针对DAA耐药的产生,推广并应用DAA-R基因检测作为预测指标指导CHC患者运用DAA进行抗HCV治疗,将对进一步优化CHC患者国内运用DAA个体化抗病毒治疗方案的制订具有指导性意义。

3)  针对DAA耐药变异株HCV生物学特性的研究

筛选出HCV针对DAA耐药的不同变异准种,构建不同类DAA不同耐药变异准种的表达质粒,并建立不同耐药变异准种稳定表达的细胞系,为将来进一步体外研究耐药变异准种HCV的生物学特性及治疗提供可靠模型。

、研究技术方法

1、病例选择:收集病例诊断300例丙型肝炎患者,诊断符合2010年《病毒性肝炎防治方案》标准。所有HCV感染者均除外HIVHBVHDVCMV等病毒感染及自身免疫性疾病、酒精性肝病及脂肪肝,并排除肝硬化、肝癌等。本研究方案已经徐州医学院附属医院医学伦理委员会批准。包括50例慢性丙型肝炎患者,年龄1640岁,符合α-干扰素抗病毒指征,无α-干扰素应用禁忌症。接受聚乙二醇α-干扰素或普通α-干扰素2b抗病毒治疗,其中聚乙二醇干扰素-α2a(派罗欣)每周一次皮下注射,每次135180 ug;普通干扰素-α2b(安福隆)每次300500万单位,皮下注射,隔日一次。。

      2、标本收集:收集丙肝病人的血清,部分病例采用干扰素治疗的,干扰素-α抗病毒治疗03612月及疗程结束后随访612月采集慢丙肝患者外周静脉血,分离血清和外周血单个核细胞(PBMCs)。部分患者于治疗前和治疗12月时进行肝组织活检。

1)血清采集:置于-20℃保存。

2PBMCs分离:采集研究对象抗凝外周静脉血,使用淋巴细胞分层液分离PBMCs。部分PBMCs在含80%胎牛血清、10DMSO10 RPMI 1640的冻存液中保存于液氮中备用。

3)肝组织活检:超声波引导下用活检枪和一次性18G肝穿针进行穿刺获取不少于2.0cm 的肝组织。肝组织常规甲醛固定,石蜡包埋,切片,HE染色。

      3、检测DAA耐药方法的建立

分离血清:取2 ml新鲜静脉血,以4000  rpm离心5 min,吸取上层血清每管分装140  ul-80冻存。RT-PCR及产物测序:采用Trizol提取总RNA,测定浓度和纯度,进行逆转录合成cDNA,设计荧光引物,对cDNA产物进行定性PCR扩增,对于荧光定量超过1000 IU/ml的样本,进行测序分析,根据测序结果根据测序结果分析有无DAA耐药变异准种。

      4DAA耐药变异准种表达质粒构建及鉴定

设计含有酶切引物,对测序含有DAA耐药变异优势准种再次进行扩增,并将产物纯化酶切,连接到pcDNA3.1pEGFP-N1中,转化细菌,挑选阳性克隆,酶切及测序鉴定。

      5DAA耐药变异准种真核表达克隆构建

采用分子克隆的方法,设计引物扩增含有DAA耐药变异准种的NS3-5的基因片段,纯化、酶切连接到pcDNA3.1pEGFP-N1中,转染HepG2Huh-7细胞,用G418筛选获得稳定表达细胞株,为体外观察变异耐药准种株的生物学特性,也为将来观察其他新的治疗药物提供选择的细胞模型。

     6DAA耐药变异准种与野生株的生物学特性比较研究

对发生DAA耐药变异准种的其它区段进行序列分析,并与野生株进行比对,观察teleprevirboceprevir有无其它新的变异(继发变异)和其它DAA交叉变异,不同基因型HCV感染者发生DAA-R比较,揭示DAA-R生物学特性。

      7DAA耐药变异准种分子流行状况研究

明确DAA原发耐药在HCV感染人群中流行状况及同一个体内动态变化。通过PCR产物直接测序方法发现存在DAA耐药变异患者和野生株患者,再采用构建A-T克隆,明确不同准种(耐药变异准种和WT)在患者体内的动态变化。即对扩增产物PCR产物凝胶纯化,PCR产物加APCR产物与pGEM-T Easy载体连接,连接产物转化,质粒提取,酶切鉴定,阳性质粒测序,分析DAA原发耐药变异在HCV感染人群中发生状况。观察部分在干扰素治疗反应不佳的患者中是否存在DAA原发耐药及耐药变异准种的体内的载量的变化。

      8DAA耐药变异发生的相关性因素研究

对于发现DAA耐药变异患者与野生株感染(无DAA耐药变异准种患者)两组患者临床指标的比较分析,探讨预测DAA耐药变异的相关质保。

1)血清学检测采用微量样本多指标流式蛋白定量技术(cytometric bead array  CBA)检测相关的细胞因子。荧光定量PCR技术检测HCV RNA水平(检测下限<1000copies/ml)。化学发光法检测检测抗-HCV。主要包括以下指标:

1)肝功能检测:留取患者的血清,采用本院全自动生化仪检测。

2IL-35IL-10TGF-β细胞因子检测:外周静脉血血清,采用ELISA法,按照加样、温浴、洗涤、读板等步骤进行,每空均设置复孔,以减少实验误差。

3)调节性T细胞(Treg)检测:留取患者外周血,送本院中心实验室,检测外周血中Treg所占频率。

4HCV基因型分析:留取标本,扩增HCV RNA,用本研究室的自动测序仪对HCV RNA进行基因型及亚型进行分析。

2肝组织学检测  1)肝脏组织病理学观察; 2)肝组织中IL-21表达  免疫组织化学(SP)法测定肝组织中IL-21的表达。

      9DAA-RWT临床及致病机制比较研究

DAA-RWT临床及致病机制比较研究:对DAA-NRWT患者的临床特点、在不同感染状态中所占比例、采用SOC治疗后反应及机体的免疫功能状况进行比较,揭示DAA-NR临床及致病机制特点。




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